CRISPR基因编辑技术简述

       CRISPR 基因编辑技术正在推动生物技术的各个方面，包括分子生物学、遗传学、肿瘤学、免疫学、农业和工业生物技术，甚至食品技术。自从它被发现以来，新公司纷纷成立，将 CRISPR 的优势推广到各个领域，许多现有的基因编辑公司也开始利用CRISPR 基因编辑 。

什么是 CRISPR？

    CRISPR 代表成簇规律间隔的短回文重复序列。CRISPR 是在古细菌和细菌等原核生物的基因组中发现的一组 DNA 序列。CRISPR 序列的特征是相同重复簇与称为间隔子的不相同片段间隔开。当病毒攻击原核生物时，这些原核 DNA 元件就衍生自病毒。随后，这些 DNA 序列参与针对侵入性遗传元件（包括病毒和质粒）的适应性免疫。CRISPR 片段与某些酶一起构成了强大的基因编辑系统的基础。因此，在现代生物学领域，术语 CRISPR 更多地表示一种基因组编辑工具，而不仅仅是编码细菌免疫力的基因序列。

谁发现了 CRISPR？

    CRISPR 重复序列是在 1987 年偶然发现的，当时是在研究大肠杆菌中负责碱性磷酸酶同工酶转化的 IAP 基因时发现的。来自大阪大学的Yoshizumi Ishino等人进行了研究，他们发现了一种奇特的重复序列，其功能在当时是未知的。在另一项关于结核分枝杆菌的独立研究中 , 荷兰的研究人员在不同的结核分枝杆菌菌株中发现了直接重复簇 (DR) 的多样性。发现 DR 的这种多态性特征可用于菌株分型，并且一直在使用。大约在同一时间，西班牙阿利坎特大学的 Francisco Mojica 和他的团队在古细菌的 Haloferax 和 Haloarcula 物种中观察到了 CRISPR 重复序列。然而，多年来，这种成簇回文重复的作用一直是个谜。

     在 2002 年，Ruud Jansen 和他的团队创造了 CRISPR 一词，并报告了一组分散在紧邻 CRISPR 位点的簇中的基因。这些基因被称为 CRISPR 相关 (Cas) 基因。因此，发现了编码 Cas1-4 蛋白的前四个 Cas 基因。随之而来的是，在国际范围内对各种细菌的CRISPR进行了多种研究。这些研究揭示了 CRISPR/Cas 系统在原核生物适应性免疫中的作用。

什么是 CRISPR-Cas9？

Cas9（CRISPR 相关蛋白 9）是一种与化脓性链球菌中的 CRISPR 适应性免疫相关的 DNA 核酸内切酶。Cas9 是一种 RNA 引导的核酸内切酶，因此可以切割几乎任何与引导 RNA 互补的 DNA 序列。

CRISPR-Cas9 是如何工作的？

    Cas9 核酸内切酶系统使用两个称为 CRISPR RNA (crRNA) 的小 RNA 分子和两个反式激活 CRISPR RNA (tracrRNA)。在天然存在的 CRISPR-Cas 系统中，一旦 crRNA-tracrRNA-Cas9 效应复合物准备就绪，Cas9 就会在噬菌体或质粒 DNA 序列中寻找特定的原型间隔区相邻基序“PAM”。该 PAM 序列仅存在于与原型间隔子本身非常接近的相或病毒 DNA 中，但它并未并入细菌的 CRISPR 序列中。通过这种方式，CRISPR-Cas9系统识别新的protospacer并在感染时识别入侵者，从而避免自身CRISPR序列的切割并提供针对病毒的免疫力。这也因此成为 CRISPR/Cas9 基因组编辑的基础。

    Doudna 和 Charpentier 通过将 crRNA 与 tracrRNA 融合（碱基配对）形成双 RNA 结构来重新设计 Cas9 核酸内切酶，该结构指导 Cas9 蛋白引入双链 (ds) 插入靶 DNA。双 tracrRNA:crRNA 在设计为单个 RNA 嵌合体时，还指导序列特异性 Cas9 dsDNA 切割。也就是说，通过操纵引导 RNA 的核苷酸序列，可以对 Cas9 系统进行编程以靶向任何 dsDNA 序列进行切割。在其他研究中，科学家们对 CRISPR 系统进行了改造，以制造可编程的转录因子，这些转录因子可以靶向并激活或沉默特定基因，从而使在全基因组范围内对基因表达进行序列特异性控制成为可能。

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