使用传统体外方法生产的 EV 的深入表征和验证由于需要大面积的细胞单层和大量的培养基，培养可能具有挑战性。该实验方法使用贴壁细胞生物反应器系统以节省空间、资源和时间的方式同时培养多种不同亚型的乳腺癌细胞系，从而能够持续生产大量用于下游实验的 EV。

一、生物反应器接种、适应和维护

培养基 A：含有 10% 胎牛血清（FBS，Merck）和 1% 青霉素/链霉素（PS，Gibco）的 DMEM（Gibco）。

培养基 B：Advanced DMEM/F-12(Gibco)、2% CDM-HD (Fibercell)、2% FBS、1% Glutamax (Gibco) 和 1% PS。

培养基C：高级 DMEM/F-12、2% CDM-HD、1% Glutamax (Gibco) 和 1% PS。

     将细胞密度培养为1.5 × 10 6 个细胞/ml 的 15 mL细胞重悬液接种到贴壁生物反应器的下部细胞室中（ Argos) 并在上层培养基室中加入 500 ml 相同培养基. 通过用培养基 A 代替培养基 C，细胞逐渐适应 CDM-HD 血清替代品（Fibercell Systems）和高级 DMEM/F12（以尽量减少 FBS 的使用）。细胞室每 3-4 天更新一次，培养基室更新一次每周。1 周后，培养基更改为 75%培养基A 和 25%培养基B。接下来的一周更改为 50% 培养基 A 和 50%培养基B，然后下一周更改为 25% 培养基 A 和 75%培养基 B。最后，在第 4 周，细胞室用 15 ml 预热的 PBS 仔细清洗 3 次以去除任何残留的 FBS  EV，并填充 15 ml 培养基 C，同时培养基室保持 500 ml 培养基 B。

      适应后，从细胞室收集 15 ml 条件培养基用于 EV 分离，并每 3-4 天（星期一和星期四）更新一次，而细胞室每 7 天（星期四）更换一次。每次更换时记录细胞室培养基体积（ml）。通过将 10 μl 完全条件培养基与 1:1 台盼蓝混合并在细胞计数仪上进行观察和计数，将其用于悬浮细胞的定量。数字以“EV Collection #”表示，其中 EV Collection #1 对应于接种后 28 天，此后每周进行两次收集。

二、常规培养物比较

BT-474 和 MDA-MB-231 细胞在 2D 烧瓶中进行血清饥饿培养，以将 EV 产量与生物反应器培养物进行比较。简而言之，细胞在标准条件下在含有 10% FBS 和 1% P/S 的 DMEM 中培养，并通过使用 TrypLE (Gibco) 在其生长期（~80% 汇合度）分裂和重新接种，将每个培养瓶增至 9× T175 烧瓶. 将 9 × T175 烧瓶接种在含血清培养基中，达到约 30% 的汇合度，一旦细胞达到约 60% 的汇合度，就用 PBS 洗涤 3 次以去除任何残留的外源性 FBS EV，并在 50 ml DMEM 中加入 1将 % P/S 添加到每个烧瓶中。48 小时后，收集条件培养基并以 2000× g离心10 分钟，然后使用 Vivaspin 50、100 kDa 浓缩器浓缩，将培养基体积从 450 毫升减少到 40 毫升。使用尺寸排阻色谱法（SEC）对来自这种浓缩条件培养基的 EV 进行超速离心和纯化。

在接种前，使用支原体染色试剂盒 (Sigma-Aldrich) 对常规细胞培养物和在生物反应器中生长的培养物进行支原体检测。

  生物反应器实验和维护示意图。(a) 双室 CELLine AD 1000 生物反应器图和用于分离和表征 EV 的工艺流程； (b) 生物反应器维护方法显示在接种和培养基适应（4 周）后每周收集两次 EV，每周更新一次培养基室；(c) 解构后对生物反应器生长表面进行成像的方法，包括 SEM 和 H&E 。

三、外泌体 EV隔离

    将来自生物反应器细胞室的 15 ml 条件培养基以 2000 × g离心10 分钟以去除细胞和其他碎片。然后按照制造商的说明使用高速离心机将上清液与 PBS 混合以达到小体积的 20 ml，以 10,000 x g离心30 分钟以沉淀大型 EV（也称为微泡）和该颗粒重新悬浮在 500 μl PBS 中并储存。然后将上清液以 100,000 x g超速离心70 分钟以产生粗制小 EV 颗粒。将该沉淀重悬于 700 μl PBS 中并储存在 -80°C 直至需要，尽量减少冷冻解冻的次数。

   将 500 μl 粗小型 EV 加载到 35 nm  qEV Original SEC 柱上，并使用自动馏分收集器（每个馏分 500 μl）收集馏分 7 至 23。对每个收集的级分进行高灵敏度 BCA 测定（Pierce，ThermoFisher Scientific）以确定它们的蛋白质浓度。一旦确定了富含 EV 的分数，只有那些富含 EV 的分数（由 NTA 填充的颗粒；F8-F10）被收集并汇集在随后的分离中。

 四、纳米粒子追踪分析

     在 PBS 中以 1:100 的比例稀释 SEC 纯化的小型 EV 个体和合并的级分，并使用 NS300 Nanosight（Malvern Analytical）或Nanocoulter Ⅰ进行测量。在低流量条件下进行表征分析，如：平均和众数粒径、浓度、电位和尺寸分布。汇集了富含 EV 的部分，并用于跟踪 EV 生产、TEM 和质谱分析。使用 Kruskal-Wallis 检验在 Graphpad Prism 中对每个细胞系的 EV 产量和 EV 相关蛋白进行统计比较（P < 0.05) 在包括 Kolmogorov–Smirnov 和 Shapiro–Wilk 测试在内的正态性测试呈阴性后。平均值以±标准偏差报告。散点图以平均值和标准偏差呈现。

五、透射电镜分析

通过吸附到 Formvar 涂层铜网格（电子显微镜科学）上 10 分钟，对小型 EV 进行负染色 TEM。用滤纸（Whatman）去除多余的液体，然后将铜网格转移到 20 μl 已过滤的 2% 乙酸双氧铀中 2 分钟。用滤纸除去多余的液体，让网格干燥 10 分钟。网格在 TEM 上以 120 kV 加速电压可视化，并拍摄图像。

六、 免疫印迹

   合并的小型 EV 以 100,000 × g超速离心浓缩70 分钟，并通过 BCA 测量蛋白质水平。通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量（4 μg/泳道）的 SEC 纯化的小型 EV 和细胞裂解物，并转移至 PVDF 膜（ Millipore) 。为防止非特异性结合，将膜与封闭溶液一起孵育使用 Pierce ECL Western Blotting Substrate (ThermoFisher Scientific) 使结合的抗体可视化，并使用化学发光凝胶成像系统进行分析。

七、无标记蛋白质组学分析（SWATH-MS）

   将EV 在真空浓缩器（中浓缩至 150 μl 的体积。加入 150 μl 7 M 尿素、2 M 硫脲、5 mM DTT、0.1% SurfactAmps X-100 的 50 mM 碳酸氢铵溶液后，将样品在声波浴中超声处理 15 分钟。通过在 56°C 的加热块中孵育 20 分钟来减少二硫键。 而后样本处理后进行SWATH 分析。

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