细胞支原体污染怎么处理

   用肉眼或光学显微镜检测支原体比较困难，所以支原体检测一般会通过PCR 的检测、DNA 染色、荧光标记、琼脂平板接种等 方法来实现。在支原体检测之前，细胞应连续培养至少两周，以便有时间让低水平的污染物生长。对于测试，在取样前至少两三天内不应更换培养基。

一、培养法

在琼脂平板/肉汤上培养被认为是检测支原体的“金标准”。在这种方法中，将细胞培养物的上清液添加到液体或半固体培养基（含有支原体生长所必需的营养物质）中。受感染的细胞培养物会在液体肉汤和琼脂平板上生长。琼脂平板上很容易看到支原体菌落。这种方法能够检测大多数支原体种类，除了少数种类。

二、PCR法

另一种用于检测支原体的方法是使用 PCR。在该技术中，使用了对各种常见感染性支原体的 16s RNA 基因特异的 PCR 引物。范围广泛的引物涵盖了几乎所有的感染性支原体。该过程中使用的引物是物种/基因特异性或通用的。这种方法快速、高效、可靠且具有成本效益。

基于传感器细胞的方法使用专门的细胞来检测培养物中支原体的存在。一旦这些细胞检测到支原体，它们就会引发一系列化学反应，从而引起明显的颜色变化。该方法灵敏度高但特异性低(Degeling, 2012)。

三、使用支原体检测试剂盒

生物发光检测试剂盒可从不同的生物技术公司获得，这些试剂盒是基于酶的支原体检测试剂盒。这些试剂盒可检测不是由真核细胞合成的支原体酶。首先，试剂盒成分会破坏支原体，然后使用特定的酶来触发产生发光的细胞机制。然后可以通过光度计检测到这一点。

可以在受感染的培养基中加入非特异性 DNA 染料来检测支原体。当在荧光显微镜下观察时，支原体 DNA 以小簇的形式出现，与细胞 DNA 分开。

四、荧光染色法

荧光 DNA 染色是另一种 DNA 染色方法。此方法使用 DAPI 和 Hoechst 33258 等 DNA 染料对所有 DNA 进行染色。在此过程中需要一些专业知识，因为结果解释可能很困难。支原体的低密度、其他细菌的污染或这些细菌产生的细胞外荧光信号会阻碍正确的结果解释。此外，来自核区域的信号使支原体的检测变得困难。

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预防支原体污染的方法

1. 加强实验室操作管理：严格控制实验室操作，加强实验服的消毒除菌，要求实验室工作人员戴口罩和手套，保证实验室的清洁。

比如通过培训合格的细胞培养人员，从而消除不规范操作所引起的支原体污染。如果可能，应提供一个单独的实验室用于细胞培养和细胞系的维护。为实验室设施提供这样的环境不仅可以减少支原体，还可以避免其他细菌和真菌污染。

另外要做好细胞室的消毒工作，熟练掌握季铵酸盐消毒液、醇类消毒液、杀孢子剂等消毒剂的使用方法，同时做好个人防护工作，比如：工作时戴上手套，使用后丢弃。确保定期更换手套和口罩，而不是将它们放在实验室外套的口袋里。

为实验室配备单独的鞋子，以避免带入细菌和环境污染物。

还有需要注意的是人类口腔中其实也含有多种支原体，当你说话、大笑、打喷嚏或咳嗽时，支原体也可能会进入细胞培养物。所以细胞室内尽量避免在实验室内打喷嚏或咳嗽或大声说话。

2. 更换污染的细胞源：更换污染的细胞源，以确保细胞的正常生长和发育。

被污染的细胞源是支原体污染扩散的主要途径之一。所以，已被污染的细胞可以直接丢弃，避免造成交叉污染，除非价格较高或典型样品。

3. 采用有效的消毒措施：采用有效的消毒措施，如紫外线消毒、甲醛消毒等，有效杀灭细胞污染源。

    4.细胞传代培养前要做好支原体污染检查

A.细胞使用前也需要检查细胞系储备液是否存在支原体污染。

B.确保用于传代培养的血清中不存在污染。避免使用过期产品或存放时间较长的试剂。

C.尽可能使用新鲜的培养基和密封紧密的培养基。

D.使用一次性移液器以避免交叉污染。

E.确保在工作之前和期间将所有必需的设备和试剂放在层流气流中。

F.在使用细胞系进行检测或分析之前，对支原体污染进行常规检查。

G.可以选择使用 0.1 微米过滤器进行过滤除菌，可以减少支原体污染的发生。

H.避免细胞培养物长时间暴露在空气中，并确保在将它们放入培养箱之前拧紧瓶盖。以防止气溶胶污染。尽量以小瓶的形式对冷冻保存的细胞系进行备份，即使冷冻保存细胞的活力随着每次传代培养而降低。

5.实验室设备与支原体污染

定期熏蒸层流和实验室设施也可以有效降低支原体污染的发生概率。

用于细胞培养的CO 2培养箱不得过度拥挤（填充不超过其容量的 60%），否则会导致支原体从一种细胞系感染到另一种细胞系。

多个细胞系不应储存在一个培养箱中，因为它会增加交叉污染的风险。

应定期清洁 CO2 培养箱，避免任何形式的潮湿。为保持湿度而提供的蒸馏水应定期更换，因为支原体、细菌和真菌可以驻留在这些容器中。

水浴锅、液氮容器、试剂瓶等感染源必须定期清洗，定期检查有无污染。

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支原体污染的处理办法：

那么你发现了支原体污染，你接下来要做什么？直接的方法是丢弃受感染的细胞培养瓶。在样本不可替代或非常昂贵的情况下，只能采取一些方法进行支原体清除来弥补损失。

支原体清除是一个非常耗时的过程，并且会增加对其他健康细胞系造成二次污染的风险。根据感染的严重程度，支原体清除可能需要几周到几个月的时间。 支必清是一种使用广泛支原体清除试剂，可以清除培养基中存在的大部分支原体。此外，BM Cyclin、氟喹诺酮环丙沙星、ciprobay、zagam、baytril、四环素等药物也可用于从受感染培养物中去除支原体。

支必清可以有效去除大部分支原体污染，使用方便，对广泛的支原体有效。虽然这些方法不能保证彻底去除支原体，但可以去除大部分支原体污染。总的来说，在进行支原体清除时，是会影响到细胞的生长和细胞活力的。

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