天根-无内毒素质粒小提中量试剂盒 -DP118采用硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶 液P4和过滤柱CS，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质；整个提取过程仅需1个小时，方便快 捷。以下操作步骤适用于提取5-15 ml过夜培养的大肠杆菌，质粒提取得率和质量与宿主菌的 种类和培养条件，细胞的裂解，质粒拷贝数，质粒的稳定性，抗生素等因素有关。 使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于转染多种细胞及各种常规操作，包括酶切、 PCR、测序、连接等实验。 提取得率 质粒类型 菌液量 得率 质粒 低拷贝 5-15 ml 5-25 µg pBR322, pACYC及其衍生载体, pSC101 及其衍生载体, SuperCos, pWE15 高拷贝 5-15 ml 15-70 µg pTZ, pUC, pBS, pGM-T 注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

储存条件

      本试剂盒在室温（15-25℃）干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于 2-8℃。（注意：当低温贮存时，使用前应将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间，必要 时可在37℃水浴中预热10 min，以平衡溶液温度）。单独包装的RNaseA在室温可稳定保存 12个月以上。加入RNaseA后的溶液P1应置于2-8℃保存，可稳定保存6个月。

 试剂盒使用注意事项

1．溶液P1在使用前 加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于 2-8℃保存。

2．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明 在漂洗液PW中加入无水乙醇。 3．使用前检查平衡液BL、溶液P2和P4是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加 热几分钟，即可恢复澄清。

4.注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。

5.所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm (~13,400×g )。

 6．提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或 大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量，洗脱缓 冲液应在65-70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。

 7．实验前使用平衡液处理吸附柱，可以充分激活硅基质膜，提高得率。

 8．用平衡液处理过的柱子 好当天使用，放置时间过长会影响效果。

TIANGEN-天根无内毒素质粒小提中量试剂盒-操作步骤

• 1. 柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请 使用当天处理过的柱子）
• 2. 取5-15 ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min，尽量吸 除上清。 注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中, 菌体量以能够充分 裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。
• 3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μl溶液P1 （请 检查是否已加入RNaseA），使用 移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
•  注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量 和纯度偏低。
• 4. 向离心管中加入500 μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。 注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠， 所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂 解不彻底，应减少菌体量。
• 5. 向离心管中加入500 μl溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色 絮状沉淀，然后室温放置10 min左右，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心10 min，此时在离 心管底部形成沉淀。 注意：P4加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再 次离心后取上清。
• 6. 将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 min，滤液收集在干净的2 ml离心管中（自备）。
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• 7. 向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇（加入异丙醇过多容易导致RNA污染），上下颠倒 混匀后转移到吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）。 注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP4的  大容积为700 μl，所以需要分次过柱。
•  8. 室温12,000 rpm (~13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集 管中。 注意：将第7步中所得溶液分次过柱，每次均按以上条件操作。
•    9. 向吸附柱CP4中加入500 μl去蛋白液PD，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉收 集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
•   10. 向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW（请 检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。 注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。
•   11. 向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min，倒掉收集 管中的废液。
•   12. 将吸附柱CP4重新放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 min，目的是将吸附 柱中残余的漂洗液去除。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实 验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸 附材料中残余的漂洗液。
•   13. 将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 μl洗脱缓 冲液TB，室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min将质粒溶液收集到离心管 中。

注意事项：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤 13。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5 范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100 μl，体积过小影响 回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。 质粒DNA浓度及纯度检测 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单 一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等 有关。OD260值为1相当于大约50 μg/ml双链DNA。 OD260/OD280比值应为1.7–1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值 会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。