细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-Alexa Fluor 647/PI）

   货号                 规格

 BDLS4002-20     20T

 BDLS4002-50      50T

 BDLS4002-100    100T 

检测方法：采用 Annexin V 与 PI 双染的方法

 储存条件：2-8℃避光保存（勿冰冻） 

    细胞凋亡检测试剂盒介绍：

      细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS) 从细胞膜内转移到细胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常 主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。

   Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性，对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用 Annexin V 与 PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。 

注意事项：

本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。此产品仅供研究，不用于临床

试剂盒组份 

1. 结合缓冲液 4× (Binding Buffer 4×) 体积：20 Tests: 4ml（4 倍浓缩液） 50 Tests: 10ml（4 倍浓缩液） 100 Tests: 20ml（4 倍浓缩液） 

稀释后溶液中各组分浓度：10mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2 2. 碘化丙锭溶液 （Propidium Iodide, PI） 

体积： 20 Tests: 0.2ml； 50 Tests: 0.5ml ；100 Tests: 1.0ml 

浓度： 20μg/ml 

3. 重组人 Annexin V/Alexa Fluor 647 , (rh Annexin V/Alexa Fluor 647 ）

来 源：大肠杆菌（E.coli） 分 子 量：35.8 KDa 

样 品 量：

20 Tests: 0.1ml，可用于 20 次实验 

 50 Tests: 0.25ml，可用于 50 次实验

 100 Tests: 0.5ml，可用于 100 次实验 

保存方法：于 50mM Tris, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4 溶液中保存 

纯 度：SDS-PAGE 及反相 HPLC 表明纯度大于 98% 

生物活性：Annexin V 可结合于磷酯酰丝氨酸并表现出抗磷酯酶活性 

实验操作步骤

 1. 细胞样品的准备：

 a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含 EDTA 的胰酶消化细胞， 至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的 贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。 

1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。 对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离 心力。小心吸除上清，可以残留约 50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。

加入约 1ml 4℃预 冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。 

b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全 离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约 1ml 4℃ 预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心 沉淀细胞，小心吸除上清。

 2. 用去离子水按 1:3 稀释结合缓冲液（4ml 4x 结合缓冲液+12ml 去离子水）；

 3. 用 1x 结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1-5x106 /ml；

 4. 取 100μl 的细胞悬液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V/Alexa Fluor 647 和 10μl 20μg/ml 的碘化丙锭溶液；混匀后于室温避光孵育 5 分钟； 

5. 加入 10ul 20ug/ml 的碘化丙锭溶液（PI）,并加 400μl PBS，立刻流式检测。 

实验设计：

 1)未转染细胞 空白管：阴性对照组细胞，不加 Annexin V/Alexa Fluor 647 ，碘化丙锭溶液(PI)。用于调节电压。 

检测管：处理的细胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 647 ，碘化丙锭溶液(PI)。

用空白管和单阳 管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

 注：无需用单染管 Annexin V/Alexa Fluor 647 调补偿。 

2) 转染 GFP 细胞 未转染空白管：未转染细胞，不加 Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙锭溶液(PI)。

用于调节 电压 转染 GFP 空白管：转染 GFP 对照组细胞，不加转染 Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙锭 溶液(PI)。

用于调节补偿 检测管：处理的细胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙锭溶液(PI)。调节好电压补偿 后，获得所需要的流式数据。

 常见问题：

 1、 Annexin V/ PI 凋亡检测的试剂盒能否检测人以外其他动物的细胞凋亡情况？

 可以。因为 Annexin V 是与磷脂酰丝氨酸(PS)亲和，而 PS 在不同种属间没差异。在正常细胞中，PS 只 3 / 3 分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，PS 由脂膜内侧翻向外侧。

 2、 贴壁细胞做凋亡用胰酶消化下来对细胞膜损伤？

 低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞 2～3 次，离心机 4℃1000rpm 5min 离心，处理得当的话，胰酶造成 损伤可以控制在 5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。

 3、 贴壁细胞可以先染 PI 然后再消化下来吗？

这样是否可以减小由于消化液造成的细胞 膜破损而染上的 PI 的误差？ 

先加 PI 不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且 PI 本身对细胞也是有毒性的，对实验结果影响会 比胰酶大，不建议这样做。

 4、 为什么只能用不含 EDTA 的胰酶消化贴壁细胞，用含 EDTA 的胰酶消化细胞对结果有 什么影响？

 因为 Annexin V 是 Ca 依赖的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA 螯合了 Ca 离子从而影响 Annexin V，进而影响结果。 

5、 有些厂家说明书 Annexin V 和 PI 一起加？为什么你们先加 Annexin V 后加 PI？ 

用流式检测凋亡时，PI 受时间的影响很大，因标记了 PI 后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致 PI 的 染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误 差会明显加大。一般 PI 加上后立刻上机，然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以，但是按照我们 操作步骤造成的误差会更小。

 6、 你们哪种凋亡检测试剂盒能用于转染 GFP 细胞的凋亡检测？

 BDLS4004 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit 凋亡检测试剂盒 BDLS4002 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Kit

细胞凋亡检测试剂盒 凋亡检测试剂盒 实验参考图片 Jurkat 细胞用顺铂诱导凋亡后用 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 双染流式分析图谱